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實(shí)驗指南

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ELISA實(shí)驗前樣本制備操作流程

2022-06-20
609次

ELISA樣本制備指南

ELISA是一種快速、靈敏、準確可靠的定性定量分析方法。樣本的處理對于Elisa實(shí)驗的成功起著(zhù)關(guān)鍵的作用。處理樣本的過(guò)程就是收集目標蛋白的過(guò)程,由于蛋白容易變性,降解,故該過(guò)程應盡量溫和。樣本處理之后的儲存也非常重要,尤其注意不要反復凍融。樣本處理之后可分裝密封保存,最佳保存條件:2-8保存應小于5天,-20不應超過(guò)6個(gè)月,-80不應超過(guò)2年,超過(guò)以上時(shí)間應保存在液氮中。凍存的標本融化時(shí),為了減少冰晶(0)對樣品的破壞,應采用15-25水浴快速融化,融化后可用于檢測或暫存于2-8。

利用ELISA進(jìn)行檢測的樣本類(lèi)型包括:血液(血清、血漿)、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等。常見(jiàn)的樣本處理方法如下,僅供參考:

A、血液樣本

1、血清:

1.1、將收集于血清分離管的全血樣本,在室溫放置2小時(shí)或2-8過(guò)夜。(這是一個(gè)讓血液自然凝固的過(guò)程,溫度越低,凝集越緩慢,可根據需要添加促凝劑)

1.2、1000×g離心20分鐘,取上清。

1.3、可立即檢測,或分裝凍存于-20-80。

2、血漿(檸檬酸,EDTA,肝素)

2.1、血漿樣本需要抗凝,將全血收集到干凈的含抗凝劑的試管中,輕輕混勻。

2.2、標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清。

2.3、可立即檢測,或分裝凍存于-20-80。

抗凝劑的類(lèi)型和選擇:

根據待檢測目標物的性質(zhì)不同選取不同的抗凝劑。

枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)Ca2+有凝血作用,枸櫞酸鈉能與血液中的Ca2+形成可溶性的螯合物,從而阻止血液凝固。檸檬酸鈉抗凝工作濃度一般為0.25%。(使用4.0%濃度規格的抗凝劑時(shí),抗凝劑與血液的比例為1:16)

缺點(diǎn):血液中溶解度低,抗凝作用較弱。

優(yōu)點(diǎn):對凝血因子有很好的保護作用,大部分凝血試驗都可用枸櫞酸鈉抗凝。

乙二胺四乙酸(EDTA)鹽:與血液中的Ca2+結合形成配位化合物,從而阻止血液凝固。EDTA的抗凝工作濃度為:10ml血液含12mgEDTA。

優(yōu)點(diǎn):對紅細胞和白細胞形態(tài)影響小。

缺點(diǎn):影響血小板的聚集。不適用于凝血實(shí)驗和血小板功能相關(guān)實(shí)驗的檢測。

肝素:通過(guò)與抗凝血酶結合,增強抗凝血酶的作用,滅活絲氨酸蛋白酶,從而阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集,阻止血液凝固。純的肝素10mg能抗凝65~125ml血液。

優(yōu)點(diǎn):抗凝能力強,不影響血細胞體積,不易溶血,能耐高溫。

缺點(diǎn):引起白細胞聚集。肝素抗凝血應于短時(shí)間內使用,否則放置過(guò)久血液又可凝固。

血清/血漿的區別與選擇:

血清是血液凝固后缺少纖維蛋白原的血漿,故血漿中除含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均等同于血清。由于血清中缺乏很多的凝血因子,但有凝血產(chǎn)物。如果檢測凝血因子,建議選擇血漿樣本;因血漿中有纖維蛋白原,如果纖維蛋白原對待檢測指標有影響,建議選擇血清樣本;大多數情況下二者均可以選擇。

B、組織樣本:

組織樣本一般制成組織勻漿,處理方法如下:

1、使用干凈的工具解剖目標組織,盡快置于冰上,以防被蛋白酶降解。(暫時(shí)不處理的組織,置于圓底微量離心管中,浸入液氮中速凍,在-80下存儲樣品備用)

2、用預冷的PBS緩沖液(0.01M,pH=7.4)洗滌組織去除殘留的血液,稱(chēng)重后備用。若組織塊較大,需先剪碎。

3、在冰上用研磨緩沖液(常用PBS緩沖液,但最好使用50mMTris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH7.3?;蛘咧械葟姸?span style="box-sizing: border-box;border-width: 0px;border-style: solid;border-color: #E5E7EB;--tw-border-spacing-x: 0;--tw-border-spacing-y: 0;--tw-translate-x: 0;--tw-translate-y: 0;--tw-rotate: 0;--tw-skew-x: 0;--tw-skew-y: 0;--tw-scale-x: 1;--tw-scale-y: 1;--tw-pan-x: ;--tw-pan-y: ;--tw-pinch-zoom: ;--tw-scroll-snap-strictness: proximity;--tw-ordinal: ;--tw-slashed-zero: ;--tw-numeric-figure: ;--tw-numeric-spacing: ;--tw-numeric-fraction: ;--tw-ring-inset: ;--tw-ring-offset-width: 0px;--tw-ring-offset-color: #fff;--tw-ring-color: rgb(59 130 246 / 0.5);--tw-ring-offset-shadow: 0 0 #0000;--tw-ring-shadow: 0 0 #0000;--tw-shadow: 0 0 #0000;--tw-shadow-colored: 0 0 #0000;--tw-blur: ;--tw-brightness: ;--tw-contrast: ;--tw-grayscale: ;--tw-hue-rotate: ;--tw-invert: ;--tw-saturate: ;--tw-sepia: ;--tw-drop-shadow: ;--tw-backdrop-blur: ;--tw-backdrop-brightness: ;--tw-backdrop-contrast: ;--tw-backdrop-grayscale: ;--tw-backdrop-hue-rotate: ;--tw-backdrop-invert: ;--tw-backdrop-opacity: ;--tw-backdrop-saturate: ;--tw-backdrop-sepia: ">RIPA細胞裂解液,注意RIPA裂解液PH值需為PH7.3,建議不要使用含NP-40,TritonX-100和高濃度DTT的組分,會(huì )抑制抗原抗體反應。)研磨組織勻漿(加入研磨緩沖液的體積取決于組織的重量。一般情況下,每1克組織碎片應使用9ml研磨緩沖液。另外建議在研磨緩沖液中加入一些蛋白酶抑制劑,如1mM PMSF)。得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進(jìn)一步處理(超聲破碎過(guò)程中,需冰浴降溫;反復凍融法可重復2)。

4、將制備好的勻漿液于5000×g離心5分鐘,留取上清即可檢測?;蚍盅b凍存于-20-80。

5、根據實(shí)驗需要,組織勻漿樣本可先定量總蛋白,以便于統計分析數據,一般調整總蛋白濃度至1-3mg/ml。某些組織樣本,如肝臟,腎臟,胰腺因含有較高濃度的內源性過(guò)氧物酶,在樣品濃度較高的情況下會(huì )和試劑盒底物反應出現假陽(yáng)性。

注意事項:

若為皮膚組織,離心后,需去除上層脂肪,以及下層沉淀,取中間層樣本用于檢測。

C、細胞樣本:

1、細胞培養上清:

1.1、使用96,24,6孔板,(貼壁或懸浮)細胞密度達到60-90%。

1.2、使用6-10mm培養皿,T25/T75細胞培養瓶,(貼壁或懸浮)細胞密度達到60-90%。

1.3、懸浮細胞:2-8,2500rpm離心5min,收集澄清的細胞培養上清。

1.4、貼壁細胞:直接收集上清液,2-8,2500rpm離心5min,收集澄清的細胞培養上清。

1.5、立即用于檢測,或分裝于-80凍存備用。

2、細胞裂解液:

2.1、懸浮細胞:

2.1.1、2-8,2500rpm離心5min,收集細胞。

2.1.2、加入預冷的PBS,輕輕混勻,2-8,2500rpm離心5min,收集細胞。

2.1.3、加入0.5-1ml中等強度RIPA細胞裂解液(注意RIPA裂解液PH值需為PH7.3,建議不要使用含NP-40,TritonX-100和高濃度DTT的組分,會(huì )抑制抗原抗體反應。若無(wú)RIPA裂解液,可使用50mMTris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH7.3)及適量蛋白酶抑制劑(PMSF,工作濃度1mmol/L),置于冰上,裂解30min-1h。裂解過(guò)程中可用槍頭吹打或間斷搖動(dòng)離心管,使蛋白充分裂解,出現黏糊狀是DNA,可以使用超聲波破碎DNA。(或用超聲波3-5mm探頭,功率150-300W,冰上超聲處理樣品,工作1-2s,停止30秒,3~5個(gè)循環(huán))

2.1.4、裂解或超聲破碎完成,2-8,10000rpm離心10min,上清移入EP管中,立即用于檢測,或分裝于-80凍存備用。

2.2、貼壁細胞:

2.2.1、吸走上清液,加入預冷的PBS洗三次。

2.2.2、加入0.5-1mlRIPA細胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(具體要求同懸浮細胞),用細胞刮輕輕刮下貼壁細胞。

2.2.3、細胞懸液轉入離心管中,置于冰上,裂解30min-1h,或者配合超聲波破碎(同懸浮細胞)。

2.2.4、裂解或超聲破碎完成,2-8,10000rpm離心10min,上清移入EP管中,立即用于檢測,或分裝于-80凍存備用。

注意事項:

細胞裂解液,建議使用超聲波輔助破碎,超聲波可有效打斷DNA,DNA成為片段后不容易干擾試劑盒工作。

細胞培養上清液/細胞裂解液的選擇:

根據目的物所在部位,可選擇細胞裂解液或細胞培養上清作為樣本。

如果目的物是分泌型,(包括可分泌型的膜蛋白),即可選擇細胞培養上清作為樣本;

如果目的物主要存在于胞內,則建議選擇細胞裂解液作為樣本類(lèi)型,部分包內蛋白也可能通過(guò)分泌或者細胞凋亡而泄露到培養基中而上清也可被檢測。

D、痰液

1、選擇痰液中較為粘稠部分稱(chēng)重,加兩倍于痰量的0.1%DTT(二硫蘇糖醇,主要作用是溶解粘液),反復吹打,漩渦器振蕩15s,37度恒溫水浴振蕩5分鐘;

2、加兩倍于痰量的PBS緩沖液,繼續振蕩15-20分鐘,150目的金屬絲網(wǎng)過(guò)濾,1500rpm離心10分鐘吸取上清液檢測。

E、唾液/尿液/牛奶

用無(wú)菌管收集樣品,2-8下以10,000xg離心2分鐘?;?span style="box-sizing: border-box;border-width: 0px;border-style: solid;border-color: #E5E7EB;--tw-border-spacing-x: 0;--tw-border-spacing-y: 0;--tw-translate-x: 0;--tw-translate-y: 0;--tw-rotate: 0;--tw-skew-x: 0;--tw-skew-y: 0;--tw-scale-x: 1;--tw-scale-y: 1;--tw-pan-x: ;--tw-pan-y: ;--tw-pinch-zoom: ;--tw-scroll-snap-strictness: proximity;--tw-ordinal: ;--tw-slashed-zero: ;--tw-numeric-figure: ;--tw-numeric-spacing: ;--tw-numeric-fraction: ;--tw-ring-inset: ;--tw-ring-offset-width: 0px;--tw-ring-offset-color: #fff;--tw-ring-color: rgb(59 130 246 / 0.5);--tw-ring-offset-shadow: 0 0 #0000;--tw-ring-shadow: 0 0 #0000;--tw-shadow: 0 0 #0000;--tw-shadow-colored: 0 0 #0000;--tw-blur: ;--tw-brightness: ;--tw-contrast: ;--tw-grayscale: ;--tw-hue-rotate: ;--tw-invert: ;--tw-saturate: ;--tw-sepia: ;--tw-drop-shadow: ;--tw-backdrop-blur: ;--tw-backdrop-brightness: ;--tw-backdrop-contrast: ;--tw-backdrop-grayscale: ;--tw-backdrop-hue-rotate: ;--tw-backdrop-invert: ;--tw-backdrop-opacity: ;--tw-backdrop-saturate: ;--tw-backdrop-sepia: ">2000-3000rpm離心20分鐘,收集上清液,可立即檢測,或分裝凍存于-20-80。盡量減少凍融循環(huán)。

F、糞便

1、盡量采集干的糞便,糞便過(guò)稀會(huì )較難處理且降低檢測的準確性。采集的重量應大于50mg。

2、將糞便用PBS3次,離心收集沉淀后稱(chēng)重。

3、加入PBS緩沖液(加入PBS緩沖液的體積取決于處理后糞便的重量。一般情況下,每1克糞便應使用9mlPBS緩沖液),用超聲粉碎(或搗碎)。

4、5000×g離心10分鐘,取上清檢測?;蚍盅b凍存于-20-80備用。

G、精漿

1、將精液收集于無(wú)菌容器中,正常精液射出體外呈稠厚的膠凍狀,射出體外后需在室溫或37度水浴箱中使其在前列腺分泌的纖維蛋白溶解酶的作用下液化變得稀薄。

2、待精液完全液化后,將精液于4000rpm離心10分鐘分離精漿,進(jìn)行檢測,或分裝凍存于-20-80備用。

H、腦脊液、肺泡灌洗液,滑膜液,腹水

采集樣品,1000×g離心20分鐘,收集上清,可立即檢測,或分裝凍存于-20-80。盡量減少凍融循環(huán)。

I、乳汁

采集樣品,2-812000rpm離心30分鐘,去除上層脂肪,以及下層沉淀,取中間層樣本用于檢測?;蚍盅b凍存于-20-80。盡量減少凍融循環(huán)。

J、蛋黃(檢測鳥(niǎo)類(lèi)igY(也稱(chēng)igG))

1、取新鮮蛋黃,用超純水稀釋10倍。

2、用鹽酸調pH5.0~5.2,2-8靜置6h,然后10000rpm離心10min,收集上清,調整PH7.2-7.4,立即用于檢測或分裝凍存于-20-80。