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怎樣制備高質(zhì)量的抗體—動(dòng)物免疫有妙招

2022-06-20
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傳統的抗體制備都是從抗原刺激免疫動(dòng)物產(chǎn)生強烈免疫應答開(kāi)始,其中單克隆抗體是從免疫動(dòng)物脾臟取B細胞與無(wú)限增殖的瘤細胞體外融合,對融合成功的雜交瘤細胞進(jìn)行亞克隆,從而根據應用目的篩選對應的細胞株,然后通過(guò)細胞培養或收集腹水進(jìn)一步純化得到抗體;而多克隆抗體是采集動(dòng)物抗血清,直接親和純化得到抗體。不管是哪種抗體的制備,都離不開(kāi)高效的動(dòng)物免疫。

單克隆抗體的制備流程示意圖多克隆抗體的制備流程示意圖

    動(dòng)物免疫利用的是生物體自身的體液免疫應答機制,通過(guò)抗原的持續刺激先后啟動(dòng)初級免疫反應和次級免疫反應,實(shí)際操作中以血清中抗體效價(jià)來(lái)衡量實(shí)際免疫效果??乖碳C體后啟動(dòng)初級反應一般會(huì )有一個(gè)滯后期,此時(shí)幼B細胞經(jīng)過(guò)克隆篩選、增殖,然后分化成記憶細胞或漿細胞。經(jīng)過(guò)滯后期,血清效價(jià)呈指數增長(cháng)達到一個(gè)峰值然后下降。初級免疫反應中,會(huì )首先分泌IgM,然后經(jīng)過(guò)抗體亞型轉換,IgG比例會(huì )升高。

次級免疫反應的啟動(dòng)依賴(lài)于記憶B細胞和記憶T細胞的數目,記憶細胞再次遇到相同抗原就能被激活,從而導致次級免疫反應的發(fā)生。當記憶細胞數目遠大于幼B細胞時(shí),次級反應啟動(dòng)更快、強度更大。次級反應相比初級反應滯后期更短,漿細胞和血清效價(jià)的峰值更高,持續時(shí)間更長(cháng)。同時(shí),此時(shí)分泌的抗體經(jīng)過(guò)親和力成熟和亞型轉換,質(zhì)量更高。

一般免疫進(jìn)程中血清效價(jià)變化曲線(xiàn)示意圖

動(dòng)物免疫一般選擇健康的年青成年雄性動(dòng)物,免疫系統發(fā)育成熟且不受性周期的影響而發(fā)生波動(dòng)。為確保動(dòng)物在整個(gè)免疫進(jìn)程中的健康無(wú)疫病狀態(tài),除了對動(dòng)物來(lái)源有要求外,飼養環(huán)境也需進(jìn)行控制。嚴格來(lái)說(shuō),動(dòng)物需飼養于SPF級屏障系統內,實(shí)施嚴格的微生物和寄生蟲(chóng)控制。

菲恩生物免疫基地小鼠飼養SPF級車(chē)間和兔飼養潔凈區

    通??乖枰扔米魟┤榛笤傩凶⑸?,抗體制備中最常用的弗氏佐劑主要成分為礦物油和羊毛脂,其中首次免疫需使用添加卡介苗或滅活的結核分枝桿菌的弗氏完全佐劑。佐劑的作用主要是延緩抗原的釋放,增強吞噬細胞的吞噬和對抗原的呈遞??乖瓨O為寶貴時(shí)可采用淋巴結內微量注射,此時(shí)可不使用佐劑,抗原只需10~100μg。

開(kāi)始一項免疫,除了上面提到的通用性原則,還需要考慮動(dòng)物種屬的選擇、免疫劑量的使用、注射方式以及間隔時(shí)間的控制。

01、抗原與免疫動(dòng)物的種屬差異越遠越好;親緣關(guān)系太近,意味著(zhù)抗原同源性高不被免疫系統識別;另外,要注意有些抗原在免疫某些種類(lèi)動(dòng)物時(shí)免疫原性極差,如胰島素對家兔、多種酶類(lèi)(如胃蛋白酶原等)對山羊等,免疫時(shí)皆不易出現抗體。

02、免疫劑量應根據抗原性強弱、分子量大小和免疫時(shí)間做相應調整??乖慷?,時(shí)間間隔長(cháng),劑量可適當加大。大動(dòng)物抗原劑量(以蛋白抗原為準)約0.5~1mg/只,小動(dòng)物約0.1~0.6mg/只。有時(shí)主觀(guān)希望加強免疫效果而不適當地加大劑量,往往會(huì )弄巧成拙。

03、 免疫注射的途徑有多種,包括足掌、肘窩、頸背部等淋巴結密集區皮下和皮內注射,另外還有肌肉注射和靜脈注射。最廣泛使用的是皮下注射方式,某些情形下皮內注射有優(yōu)勢。

常見(jiàn)的免疫注射途徑

04、免疫間隔時(shí)間也是重要因素,特別是首次與第二次之間更應注意。第一次免疫后,一般以間隔10~20天為好。二次以后每次的間隔一般為7~10天,不能太長(cháng),以防刺激變弱,抗體效價(jià)不高。免疫的總次數多為5~8次,半抗原需經(jīng)長(cháng)時(shí)間的免疫才能產(chǎn)生高效價(jià)抗體,有時(shí)總時(shí)間為一年以上。

建議:實(shí)際操作中,免疫劑量、免疫部位以及間隔時(shí)間的組合都會(huì )對免疫結果產(chǎn)生較大影響,需對抗血清效價(jià)進(jìn)行監控,根據實(shí)際的免疫效果調整,不可生搬硬套。